Comment Quantifier l'ADN et l'ARN
Une fois que vous avez isolé et préparé votre ADN ou ARN, vous devez déterminer la quantité avec laquelle vous travaillez avant de pouvoir l'utiliser pour un test de PCR ou de séquençage. Il existe plusieurs méthodes pour quantifier l'ADN et l'ARN, parmi lesquelles les plus couramment utilisées sont l'absorbance UV et la fluorescence. Voici une brève explication de ces méthodes, de leurs différences et de la façon de les mettre en œuvre.
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1.Quantifier l'ADN ou l'ARN en utilisant l'absorbance UV
La méthode d'absorbance UV est largement utilisée pour quantifier l'ADN et l'ARN en raison de sa rapidité, de sa simplicité et de sa capacité à fournir des informations sur la qualité de l'échantillon. Cependant, il convient de noter que cette méthode ne permet pas de différencier l'ADN de l'ARN, n'est pas suffisamment sensible pour détecter de faibles concentrations et peut manquer de précision en présence de contaminants.
Voici comment fonctionne cette méthode :
Elle consiste à mesurer l'absorbance de la lumière à une longueur d'onde spécifique à travers un liquide (par exemple, de l'eau ou un tampon) pour déterminer la concentration d'ADN et d'ARN dans ce liquide. Bien que les acides nucléiques absorbent principalement à 260 nm, plusieurs contaminants absorbent également fortement à des longueurs d'onde proches de 260 nm. De plus, la présence de solvants organiques et de protéines peut fausser la lecture à 260 nm, ce qui entraîne une estimation erronée de la concentration d'ADN ou d'ARN.
Il est important de retenir les longueurs d'onde suivantes :
- Les acides nucléiques absorbent principalement à 260 nm.
- Les protéines absorbent principalement à 280 nm.
- Les composés organiques et les sels chaotropiques absorbent principalement à 230 nm.
Pour mesurer la concentration d'ADN ou d'ARN dans votre échantillon, vous aurez besoin d'un spectrophotomètre équipé de cuvettes transparentes aux UV, ou vous pouvez utiliser un spectrophotomètre à microvolume tel que le NanoDrop.
L'utilisation d'un spectrophotomètre suit généralement ces trois étapes simples :
- Diluez votre ADN ou ARN dans de l'eau ou un tampon sans nucléase, comme un tampon TE.
- Mesurez le blanc à 260 nm en utilisant de l'eau ou un tampon sans ADN/ARN pour obtenir l'absorbance de fond.
- Mesurez l'absorbance de l'échantillon d'ADN ou d'ARN dilué à 260 nm (A260).
La concentration d'ADN ou d'ARN peut être calculée à l'aide de l'équation de Beer-Lambert (heureusement, de nombreux instruments effectuent ce calcul automatiquement) : A = εCL.
- C : concentration d'acide nucléique en molaire (M).
- A : absorbance UV en unités d'absorbance (AU).
- ε : coefficient d'absorption molaire dépendant de la longueur d'onde (ou coefficient d'extinction) en M⁻¹ cm⁻¹.
- L : longueur du trajet lumineux en cm.
Si votre instrument ne calcule pas automatiquement la concentration, vous pouvez utiliser les équations et les valeurs clés suivantes pour obtenir une estimation assez précise :
Concentration d'ADN (µg/mL) = lecture A260 x facteur de dilution x 50 µg/mL Concentration d'ARN (µg/mL) = lecture A260 x facteur de dilution x 40 µg/mL
Résumé des valeurs clés :
- Mesure : Longueur d'onde (nm)
- Quantification de l'ADN : A260, A260 de 1 = ~50 µg/ml
- Quantification de l'ARN : A260, A260 de 1 = ~40 µg/ml
- Contamination protéique : A260/A280, valeur idéale 1,8-2,0
- Contamination par des composés organiques et salins chaotropiques : A260/A230, valeur idéale >1,5
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2.Quantifier l'ADN ou l'ARN à l'aide de la fluorescence
La quantification de l'ADN ou de l'ARN par fluorescence est une méthode sensible et adaptée à la détection de faibles concentrations, ce qui en fait une option précieuse pour quantifier l'ADN ou l'ARN en vue du séquençage. Contrairement aux méthodes spectrophotométriques, cette méthode permet de différencier spécifiquement l'ADN de l'ARN, et la contamination a un impact minimal sur les résultats.
Voici comment cette méthode fonctionne :
Elle utilise des colorants fluorescents qui se lient sélectivement à l'ADN ou à l'ARN. Lorsque le colorant se lie à la cible, il émet un signal fluorescent qui peut être détecté à l'aide d'un fluorimètre.
Pour quantifier les concentrations d'acides nucléiques dans votre échantillon, vous devez d'abord générer une courbe d'étalonnage en utilisant des échantillons standards de concentrations connues. Bien que cela nécessite un peu de temps au départ, une fois que vous disposez d'une courbe standard fiable, il devient rapide et facile de mesurer les concentrations de vos échantillons à l'avenir.
La courbe d'étalonnage typique de fluorescence pour la quantification de l'ARN/ADN est un graphique montrant la fluorescence en fonction de la concentration connue des échantillons standards. Une fois que vous avez cette courbe standard, vous pouvez comparer la fluorescence de votre échantillon à celle de la courbe pour déterminer la concentration d'ADN ou d'ARN. De nombreux fluorimètres sont capables de calculer automatiquement la concentration de l'échantillon en fonction de la courbe standard.
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3.Autres méthodes pour quantifier l'ADN ou l'ARN
Il existe plusieurs méthodes alternatives pour quantifier l'ADN ou l'ARN, notamment l'électrophorèse sur gel et la PCR en temps réel (qPCR).
L'électrophorèse sur gel permet de séparer les fragments d'ADN ou d'ARN en fonction de leur taille. En comparant l'intensité des bandes sur le gel à des échantillons de référence de concentrations connues, vous pouvez estimer la concentration de votre échantillon. Cette méthode est utile pour évaluer la taille et la qualité de l'ADN ou de l'ARN, détecter la présence de contaminants et estimer la distribution des tailles.
La PCR en temps réel, également appelée qPCR, est une méthode extrêmement sensible qui permet de quantifier précisément l'ADN ou l'ARN. Elle consiste à amplifier spécifiquement des séquences cibles dans votre échantillon à l'aide de réactifs spéciaux et de sondes ou de colorants fluorescents. Pendant le processus d'amplification, la fluorescence générée est mesurée à chaque cycle, ce qui permet de suivre l'accumulation de l'ADN ou de l'ARN cible. En utilisant des échantillons de référence de concentrations connues, vous pouvez créer une courbe d'étalonnage et quantifier la concentration de votre échantillon inconnu avec précision.
Ces méthodes alternatives nécessitent généralement plus de temps pour la configuration, des réactifs plus coûteux et des équipements plus avancés par rapport aux méthodes d'absorbance UV ou de fluorescence. Cependant, elles offrent des avantages importants. L'électrophorèse sur gel permet une évaluation de la taille et de la qualité de l'ADN ou de l'ARN, tandis que la qPCR est extrêmement sensible et peut quantifier de manière précise des sous-ensembles spécifiques d'acides nucléiques en fonction de leur séquence.
