Comment Créer et appliquer des tampons d'extraction d'ARN courants

Cette méthode est efficace pour extraire l'ARN total ou l'ARN viral, mais elle n'est généralement pas appropriée pour purifier des ARN courts tels que l'ARNsi, l'ARNmi, l'ARNg et l'ARNt.

Elle repose sur une technique d'extraction liquide-liquide qui implique la séparation des phases d'un échantillon aqueux mélangé à une solution de phénol-chloroforme. En utilisant du thiocyanate de guanidium, les acides nucléiques se répartissent dans la phase aqueuse tandis que les protéines se répartissent dans la phase organique de phénol. En ajustant le pH à des conditions acides (pH 4-6), l'ADN est entraîné dans la phase organique tout en préservant l'ARN dans la phase aqueuse (car à pH neutre, à la fois l'ADN et l'ARN se répartissent dans la phase aqueuse).

Les étapes de base de cette méthode comprennent les actions suivantes (les réactifs et les recettes sont présentés dans le tableau ci-dessous) :

1. Homogénéiser les cellules en utilisant la solution de lyse cellulaire (et une matrice de lyse si nécessaire).
2. Transférer l'homogénat dans un nouveau tube et ajouter de l'acétate de sodium, du phénol saturé d'eau, du chloroforme/alcool isoamylique ou du bromochloropropane en mélangeant après chaque ajout. Ensuite, incuber à une température fraîche.
3. Centrifuger l'échantillon et transférer la phase aqueuse supérieure (contenant l'ARN) dans un nouveau tube.
4. Procéder à la précipitation, au lavage et à la remise en suspension de l'ARN extrait.

Étape 1 : Réactifs et préparation

Solution de lyse cellulaire (concentration finale)

• Thiocyanate de guanidine 4 M
• Citrate de sodium 25 mM
• 0,5% Sarkosil
• 0,1 M 2-ME

Préparation de la solution mère :

1. Mélanger les ingrédients suivants :

   • 293 ml d'eau
   • 17,6 ml de citrate de sodium 0,75 M, pH 7,0
   • 26,4 ml de N-lauroylsarcosine (Sarkosyl) à 10 % (p/v)
   • Ajouter 250 g de thiocyanate de guanidine

2. Agiter à 60° à 65°C jusqu'à dissolution complète.

3. Conserver jusqu'à 3 mois à température ambiante.

Préparation de la solution de travail (50 ml) :

Mélanger 50 ml de solution mère avec 0,35 ml de 2-mercaptoéthanol (2-ME).

Conserver jusqu'à 1 mois à température ambiante.

Étape 2 : Réactifs et préparation

Acétate de sodium 2 M, pH 4 :

1. Ajouter 16,42 g d'acétate de sodium (anhydre) à 40 ml d'eau et 35 ml d'acide acétique glacial.

2. Ajuster le pH à 4 en utilisant de l'acide acétique glacial.

3. Diluer à 100 ml avec de l'eau.

Conserver jusqu'à 1 an à température ambiante.

Phénol saturé d'eau :

1. Dissoudre 100 g de cristaux de phénol dans de l'eau à 60° à 65°C.

2. Retirer la phase aqueuse supérieure.

Conserver jusqu'à 1 mois à 4°C. Ne pas utiliser de phénol tamponné à la place du phénol saturé d'eau.

49:1 (v/v) chloroforme/alcool isoamylique (ou bromochloropropane) :

N/A (Cette étape n'inclut pas de préparation de réactifs)

Étape 3 : Réactifs et préparation

Centrifuger et transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube - aucun réactif nécessaire

Étape 4 : Réactifs et préparation

Précipitation : 100 % d'isopropanol

Lavage : 75 % d'éthanol

Préparation d'alcool à 75 % : À 1 litre d'alcool à 95 %, ajouter 294 ml d'eau traitée au DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).

Remise en suspension : eau traitée au DEPC

Préparation d'eau traitée au DEPC : Ajouter 1 mL de DEPC frais à 1 L d'eau. Bien agiter pour disperser le DEPC à travers l'eau. Incuber à 37°C pendant au moins 12 h et/ou autoclaver à 15 psi sur cycle liquide pendant 20 min pour inactiver le DEPC restant.