Comment Quantifier les protéines purifiées

Le dosage BCA est largement utilisé pour la quantification des protéines en raison de sa sensibilité et de sa facilité d'utilisation. Il implique deux réactions principales : la réaction de Biuret, où les ions cuivriques sont réduits par les protéines en milieu alcalin, et la chélation du BCA avec l'ion Cu+. Cette dernière réaction provoque un changement de couleur de l'échantillon, passant du bleu au violet, et produit un complexe BCA-cuivre stable qui absorbe la lumière à une longueur d'onde de 562 nm.

Voici les réactifs nécessaires pour le dosage BCA :

Solution A : Dissoudre 1 g de bicinchoninate de sodium (BCA), 2 g de carbonate de sodium, 0,16 g de tartrate de sodium, 0,4 g de NaOH et 0,95 g de bicarbonate de sodium dans suffisamment d'eau distillée pour obtenir un volume final de 100 ml. Ajuster le pH à 11,25 en utilisant de la solution de NaOH 10 M.

Solution B : Dissoudre 0,4 g de sulfate cuivrique (pentahydraté) dans 10 ml d'eau distillée.

Solution de travail standard : Préparer une solution en mélangeant 50 volumes de Solution A avec 1 volume de Solution B. Cette solution de travail standard est stable pendant une semaine et devrait présenter une couleur verte.

Voici le protocole général pour le dosage BCA :

1. Préparer les échantillons de protéines à une concentration comprise entre 0,2 et 50 µg/µL.

2. Ajouter 1 ml de la solution de travail standard à chaque échantillon de protéines et vortexer pour assurer un mélange homogène.

3. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à une température de 60°C pour permettre la réaction de chélation du BCA avec les protéines.

4. Après l'incubation, refroidir les échantillons à température ambiante ou sur de la glace.

5. Mesurer l'absorbance des échantillons à une longueur d'onde de 562 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

6. Pour déterminer la quantité de protéines dans chaque échantillon, comparez l'absorbance mesurée à une courbe standard d'absorbance préalablement préparée en fonction des microgrammes de protéines.

En utilisant cette courbe standard, vous pourrez estimer la concentration en protéines de vos échantillons en fonction de l'absorbance mesurée lors de l'étape 5 du protocole.

Le test de Bradford est une méthode couramment utilisée pour quantifier les protéines. Il se base sur la liaison des protéines au colorant bleu brillant de Coomassie G-250, principalement aux résidus d'arginine, de tryptophane, de tyrosine, d'histidine et de phénylalanine, ce qui entraîne un changement de couleur de brun à bleu intense. La concentration en protéines peut être déterminée en mesurant l'absorbance de la solution à une longueur d'onde de 595 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

Voici les étapes générales pour quantifier les protéines à l'aide du test de Bradford :

1. Vous pouvez utiliser une solution de Bradford commercialement disponible ou préparer votre propre solution selon les étapes suivantes :

   • Dissoudre 100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250 dans 50 ml d'éthanol à 95 %.
   • Ajouter 100 ml d'acide phosphorique à 85 % (p/v).
   • Diluer le mélange à 1 litre une fois que le colorant est complètement dissous.
   • Filtrer la solution juste avant utilisation. La solution de Bradford doit avoir une couleur marron clair.

2. Diluez votre échantillon si nécessaire pour obtenir une concentration appropriée.

3. Facultatif : Si vos échantillons ne sont pas facilement solubles dans la solution de Bradford (vous observerez des grumeaux bleus), ajoutez un volume égal de NaOH 1 M à chaque échantillon et vortexez délicatement (mais soigneusement pour éviter que l'échantillon ne se renverse de la cuvette). Ajoutez également du NaOH aux échantillons standards si vous effectuez cette étape.

4. Préparez des standards contenant une gamme de concentrations de 5 à 100 microgrammes de protéines (l'albumine ou la gamma globuline sont recommandées) dans un volume de 100 µl.

5. Ajoutez 5 ml du réactif colorant de Bradford à chaque échantillon et aux échantillons standards, puis incubez à température ambiante pendant 5 minutes.

6. Mesurez l'absorbance de chaque échantillon à une longueur d'onde de 595 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

7. Comme pour le test BCA, comparez l'absorbance mesurée à une courbe standard d'absorbance préalablement générée en fonction des microgrammes de protéines pour calculer la concentration de vos échantillons d'origine.

En utilisant cette courbe standard, vous pourrez estimer la concentration en protéines de vos échantillons en fonction de l'absorbance mesurée lors de l'étape 6 du protocole.

Pour quantifier les protéines à l'aide de l'absorbance UV, vous pouvez suivre le protocole suivant :

1. Chauffez la lampe UV du spectrophotomètre pendant 15 minutes pour assurer sa stabilité.

2. Réglez la longueur d'onde du spectrophotomètre sur 280 nm, car les protéines absorbent principalement à cette longueur d'onde en raison de la présence d'acides aminés aromatiques tels que la tyrosine et le tryptophane, ainsi que de la phénylalanine et des liaisons disulfure qui contribuent également légèrement à l'absorbance.

3. Étalonnez la lampe UV à zéro absorbance en utilisant un blanc, qui est une solution tampon dépourvue de protéines. Cela permet de compenser l'absorbance due à la solution tampon elle-même.

4. Mesurez l'absorbance de votre solution de protéines en utilisant le spectrophotomètre réglé à 280 nm. Assurez-vous de prendre en compte le blanc lors de la mesure en soustrayant l'absorbance de la solution tampon à l'absorbance de votre échantillon de protéines.

5. Si vous suspectez une contamination par des acides nucléiques dans votre échantillon de protéines, vous pouvez effectuer une mesure supplémentaire à une longueur d'onde de 260 nm. Les acides nucléiques absorbent principalement à cette longueur d'onde. Ajustez donc la longueur d'onde du spectrophotomètre à 260 nm et répétez les étapes 3 et 4 pour mesurer l'absorbance à 260 nm de votre échantillon.

En utilisant les valeurs d'absorbance obtenues à 280 nm et éventuellement à 260 nm, vous pouvez comparer ces mesures à une courbe standard préalablement établie à partir de protéines de concentration connue pour estimer la concentration en protéines de votre échantillon.

La quantification des protéines à l'aide de l'absorbance UV peut être réalisée en suivant les étapes suivantes :

1. Chauffez la lampe UV du spectrophotomètre pendant 15 minutes pour assurer sa stabilité.

2. Réglez la longueur d'onde du spectrophotomètre sur 280 nm, car les protéines absorbent principalement à cette longueur d'onde en raison de la présence d'acides aminés aromatiques tels que la tyrosine et le tryptophane, ainsi que de la phénylalanine et des liaisons disulfure qui contribuent également légèrement à l'absorbance.

3. Étalonnez la lampe UV à zéro absorbance en utilisant un blanc, qui est une solution tampon dépourvue de protéines. Cela permet de compenser l'absorbance due à la solution tampon elle-même.

4. Mesurez l'absorbance de votre solution de protéines en utilisant le spectrophotomètre réglé à 280 nm. Assurez-vous de prendre en compte le blanc lors de la mesure en soustrayant l'absorbance de la solution tampon à l'absorbance de votre échantillon de protéines.

5. Si vous soupçonnez une contamination par des acides nucléiques dans votre échantillon de protéines, vous pouvez effectuer une mesure supplémentaire à une longueur d'onde de 260 nm. Les acides nucléiques absorbent principalement à cette longueur d'onde. Ajustez donc la longueur d'onde du spectrophotomètre à 260 nm et répétez les étapes 3 et 4 pour mesurer l'absorbance à 260 nm de votre échantillon.

Pour calculer la concentration en protéines, vous pouvez utiliser les formules suivantes :

• Échantillon de protéine pure avec un coefficient d'absorbance connu :
  • Concentration (mg/ml) = Absorbance à 280 nm divisée par le coefficient d'absorbance. En supposant une longueur de trajet de 1 cm.
• Protéines ou mélanges de protéines inconnus :
  • Concentration (mg/ml) = Absorbance à 280 nm divisée par la longueur de trajet (habituellement 1 cm).
• Échantillons inconnus susceptibles d'être contaminés par les acides nucléiques :
  • Concentration (mg/ml) = (1,55 x A280) - (0,76 x A260).

La concentration pour les protéines pures connues peut être exprimée en mg/ml, en pourcentage (%), ou en molarité selon le coefficient utilisé. mg/ml = % de protéine/10 = molarité/poids moléculaire de la protéine.