Les oligonucléotides sont synthétisés via une phase solide. Ainsi, les nucléotides sont attachés selon la séquence de votre choix au fur et à mesure de la synthèse. Il est généralement connu que les réactions chimiques n'atteignent jamais une conversion à 100%. Dans la synthèse d'oligonucléotides de pointe, des rendements de couplage allant jusqu'à 99,5% sont atteints. Avec les 0,5 % de brins n'ayant pas réagi, l'assemblage en chaîne s'arrête et des séquences tronquées se forment comme produits secondaires. Selon l'application prévue, il peut être intéressant d'éliminer ces séquences plus courtes. C'est pourquoi Microsynth propose différentes purifications.
Dessalé
Tous nos oligos sont au moins dessalés pour éliminer en grande partie les sous-produits résiduels de faible poids moléculaire qui se forment et s'accumulent lors des réactions chimiques de synthèse. Cette purification est suffisante pour les oligonucléotides de moins de 30 nt et/ou les oligonucléotides utilisés pour des applications moins exigeantes telles que la PCR, le séquençage, probing, mobility shift ou l'hybridation. Les oligos dessalés ne sont pas recommandés pour les projets de clonage moléculaire.
Applications potentielles :
- PCR
- Séquençage de l'ADN
- Probing
- Mobility shift ou hybridation
RP-HPLC Purification
Les oligos de longueur <50 nt peuvent être bien purifiés par RP-HPLC (reverse-phase high-performance liquid chromatography). Grâce à cette approche de purification, les oligos résiduels tronqués n-x (dépourvus du groupe de protection hydrophobe DMT à l'extrémité 5') sont éliminés. Il en résulte une pureté de l'oligonucléotide ciblé ≥85%. La RP-HPLC est utile pour un niveau de pureté plus élevé requis pour des applications plus exigeantes telles que le clonage, DNA fingerprinting, la PCR en temps réel, le FISH, etc.
Applications potentielles :
- Molecular cloning
- DNA fingerprinting
- Real-Time PCR et digital PCR*
- FISH
* Les amorces et les sondes qPCR de Microsynth sont compatibles avec tous les supermélanges disponibles dans le commerce.
IEX-HPLC Purification
IEX-HPLC (ion-exchange high-performance liquid chromatography) est une méthode de purification privilégiée pour les oligonucléotides plus longs (40-80 nt). Grâce à cette approche de purification, les oligos tronqués n-x résiduels sont éliminés efficacement. Alors que la purification RP donne de très bons résultats pour les oligos < 50 nt, la purification IEX est supérieure pour les oligonucléotides plus longs. (40-80 nt). Pour les Oligos de cette longueur, IEX donne des résultats de pureté ≥85% de l'oligonucléotide ciblé. IEX est utile pour un niveau de pureté supérieur des oligonucléotides longs requis pour des applications plus exigeantes telles que le clonage direct ou les applications NGS.
Applications potentielles :
- Clonage moléculaire (clonage direct)
- Applications NGS
Purification HPLC et Dialyse
La dialyse en complément de la purification HPLC est recommandée si les oligos doivent être présents dans un état physiologique. Lors d'expériences in vivo (par exemple chez la souris), ce niveau de pureté est fortement recommandé.
Applications potentielles :
- Expériences antisens
- Études sur culture cellulaire
- Physico-chimie et analyse de structure (RMN, MS, etc.)
Purification PAGE
La purification par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est généralement nécessaire pour les oligos longs (>50 bases) et pour toutes les amorces ayant des séquences 5' critiques (sites d'endonucléase de restriction, promoteurs ARN). C'est la meilleure méthode pour différencier les oligos longs des séquences tronquées (oligos n-1), en fonction de la taille, de la conformation et de la charge. La purification par PAGE a une excellente résolution et donne un produit qui est, en moyenne, pur à ≥95%. Dans ce contexte, il est important de noter que le niveau de pureté diminue avec l'augmentation de la longueur de l'oligonucléotide, et cela est particulièrement vrai pour les oligos jusqu'à 120 bases. La purification par PAGE est fortement recommandée pour les expériences exigeantes telles que le clonage, la mutagenèse, fingerprinting ADN, l'hybridation in situ, la synthèse de gènes, etc.
